Определение инвертазы в почве. Методы определения активности ферментов различных классов. Материалы и методы исследования

Процессы обмена веществ и энергии при разложении и синтезе органических соединений, переход трудно усвояемых питательных веществ в формы, легкодоступные для растений и микроорганизмов, происходят при участии ферментов.

Фермент инвертаза (а-фруктофуранозидаза) катализирует расщепление различных углеводов на молекулы глюкозы и фруктозы.

Многими данными подтверждается связь между активностью инвер-тазы с биологической активностью почвы, содержанием в ней органического вещества, урожайностью полевых культур и изменениями, происходящими в почве при сельскохозяйственном использовании (Хазиев Ф.Х., 1972; Галстян А.Ш., 1978; Васильева Л.И., 1980).

С увеличением глубины вспашки активность инвертазы в верхнем слое почвы несколько снижалась, что объясняется обеднением этого слоя почвы, так как при глубоких вспашках основное количество растительных остатков заделывается в нижние слои. Аккумуляция большей части послеуборочных остатков в верхнем слое почвы при безотвальных обработках вызывает снижение активности инвертазы в слое 30-40 см к концу вегетации растений на 5-15 %.

На удобренном фоне активность инвертазы повышалась в среднем на 5 % лишь по вспашке. По безотвальным приемам обработки почвы удобрения не оказали влияния на активность этого фермента.

Действие уреазы связано с гидролитическим расщеплением связи между азотом и углеродом (СО-ИН) в молекулах азотсодержащих органических соединений. Поэтому многими исследователями отмечается положительная корреляция активности уреазы с содержанием азота и гумуса в почвах. Однако активность уреазы зависит не только от общего количества гумуса, сколько от его качества, коррелируя главным образом с величиной отношения углерода к азоту (С: 14). Органическому веществу с наиболее широким отношением углерода к азоту соответствует наибольшая активность уреазы, при уменьшении величины отношения углерода к азоту снижается и активность фермента. Это, по мнению В.Д. Мухи и Л.И. Васильевой, указывает на регулирующее действие уреазы на процессы превращения в почве азотсодержащих органических соединений. В наших исследованиях среди вариантов отвальной обработки наибольшая активность уреазы проявлялась по вспашке на глубину 20-22 см. Углубление обработки приводило к значительному снижению активности этого фермента. Так, в начале вегетации растений по вспашке на 35-37 см в слое почвы 0-40 см выделялось аммиака на 20 % меньше, чем по обработке на нормальную глубину 20-22 см (среднее за 1980-1982 гг., мг ЙН 3 на 1 г воздушно-сухой почвы).

Интенсивность и направленность процессов трансформации органического вещества в почве определяется и активностью окислительно -восстановительных ферментов полифенолоксидазы и пероксидазы. По-лифенолоксидаза участвует в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса (Мишустин Е.Н. и др., 1956, Кононова М.М., 1963, 1965). В разложении же гумусовых веществ большое место отводится пероксидазе и каталазе (Никитин Д.И., 1960). Исследователи отмечают высокую положительную корреляционную связь разложения гумуса с пероксидазной активностью и почти функциональную отрицательную связь с активностью полифенолоксидазы (Чундерова А.И., 1970, Дульгеров А.Н., 1981). Противоположная направленность функций пероксидазы и полифенолоксидазы и единый объект их применения дали возможность А.И. Чундеровой предложить понятие «коэффициент накопления гумуса», величина которого определяется отношением полифенолоксидазной активности почвы к перокси-дазной.

По данным наших исследований, увеличение глубины вспашки с 20-22 см до 35-37 см и применение безотвальных обработок почвы плоскорезом, плугом без отвалов, чизелем, орудием типа «параплау», стойками СибИМЭ, а также при обработке почвы по типу «No-til» приводили к повышению активности пероксидазы на 4-6 % и снижению активности полифенолоксидазы на 4-5 % (табл. 15). Коэффициент накопления гумуса при этом снижался на 8-10 %.

15. Активность пероксидазы и полифенолоксидазы в слое почвы 0-40 см под горохом, мг пурпургаллина на 100 г воздушно-сухой

почвы за 30 мин. (1980-1982 гг.)

Исследованиями установлена связь коэффициента накопления гумуса с отношением числа микроорганизмов, ассимилирующих минеральный азот, к числу микроорганизмов, усваивающих азот органических соединений, (КАА: МПА). Коэффициент корреляции между двумя показателями равен -0,248±0,094. Увеличение первого показателя во многих случаях приводит к уменьшению последнего и наоборот, что подтверждает наличие связи между структурой микробного ценоза и направленностью процесса биохимической трансформации органического вещества почвы. Отношение этих двух коэффициентов, видимо, может характеризовать направленность культурнопочвообразовательного процесса.

Это позволяет сделать вывод, что трансформация органического вещества почвы, обусловленная активностью пероксидазы и полифено-локсидазы, при углублении вспашки и обработках без оборота пласта смещается в сторону усиления разложения гумуса (рис. 5).

• ? Ряд4
• ? РядЗ
• ? Ряд2
• ? Ряд1

Рис. 5. Влияние различных способов и глубины основной обработки на активность пероксидазы в слое почвы 0-40 см в период 2-4 пар настоящих листьев у подсолнечника, мг пурпургаллина на 1 г воздушно-сухой почвы (1989-1991 гг.)

Определенное место в направленности и интенсивности биохимических процессов, протекающих в почве, занимает фермент каталаза. В результате ее активизирующего действия происходит расщепление перекиси водорода на воду и свободный кислород. Есть мнение, что каталаза наряду с пероксидазой может участвовать в реакциях пероксидазного типа, в ходе которых окислению подвергаются восстановленные соединения. В опытах НИИСХ ЦЧП им. В.В. Докучаева не установлено зависимости активности каталазы от глубины или способов основной обработки почвы. Однако при увеличении глубины вспашки свыше 25-27 см, а также по обработке почвы без оборота пласта отмечалось достоверное повышение каталазной активности по сравнению со вспашкой на глубину 20-22 см и 25-27 см.

Ферменты - это катализаторы химических реакций белковой природы, отличающиеся специфичностью действия в отношении катализа определенных химических реакций. Они являются продуктами биосинтеза всех живых почвенных организмов: древесных и травянистых растений, мхов, лишайников, водорослей, микроорганизмов, простейших, насекомых, беспозвоночных и позвоночных животных, представленных в природной обстановке определенными совокупностями - биоценозами.

Биосинтез ферментов в живых организмах осуществляется благодаря генетическим факторам, ответственным за наследственную передачу типа обмена веществ и его приспособительную изменчивость. Ферменты являются тем рабочим аппаратом, при помощи которого реализуется действие генов. Они катализируют в организмах тысячи химических реакций, из которых в итоге слагается клеточный обмен. Благодаря им химические реакции в организме осуществляются с большой скоростью.

В настоящее время известно более 900 ферментов. Их подразделяют на шесть главных классов.

1. Оксиредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.

2. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных химических групп и остатков.

3. Гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей.

4. Лиазы, катализирующие реакции присоединения групп по двойным связям и обратные реакции отрыва таких групп.

5. Изомеразы, катализирующие реакции изомеризации.

6. Лигазы, катализирующие химические реакции с образованием связей за счет АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты).

При отмирании и перегнивании живых организмов часть их ферментов разрушается, а часть, попадая в почву, сохраняет свою активность и катализирует многие почвенные химические реакции, участвуя в процессах почвообразования и в формировании качественного признака почв - плодородия. В разных типах почв под определенными биоценозами сформировались свои ферментативные комплексы, отличающиеся активностью биокаталитических реакций.

В. Ф. Купревич и Т. А. Щербакова (1966) отмечают, что важной чертой ферментативных комплексов почв является упорядоченность действия имеющихся групп ферментов, которая проявляется в том, что обеспечивается одновременное действие ряда ферментов, представляющих различные группы; исключаются образование и накопление соединений, имеющихся в почве в избытке; излишки накопившихся подвижных простых соединений (например, NH 3) тем или иным путем временно связываются и направляются в циклы, завершающиеся образованием более или менее сложных соединений. Ферментативные комплексы являются уравновешенными саморегулирующимися системами. В этом основную роль играют микроорганизмы и растения, постоянно пополняющие почвенные ферменты, так как многие из них являются короткоживущими. О количестве ферментов косвенно судят по их активности во времени, которая зависит от химической природы реагирующих веществ (субстрата, фермента) и от условий взаимодействия (концентрации компонентов, рН, температуры, состава среды, действия активаторов, ингибиторов и т.д.).

В данной главе рассматривается участие в некоторых химических почвенных процессах ферментов из класса гидролаз - активность инвертазы, уреазы, фосфатазы, протеазы и из класса оксиредуктаз - активность каталазы, пероксидазы и полифенолоксидазы, имеющих большое значение в превращении азот- и фосфорсодержащих органических веществ, веществ углеводного характера и в процессах образования гумуса. Активность этих ферментов - существенный показатель плодородия почв. Кроме того, будет охарактеризована активность этих ферментов в лесных и пахотных почвах разной степени окультуренности на примере дерново-подзолистых, серых лесных и дерново-карбонатных почв.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Инвертаза - катализирует реакции гидролитического расщепления сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы, воздействует также на другие углеводы с образованием молекул фруктозы - энергетического продукта для жизнедеятельности микроорганизмов, катализирует фруктозотрансферазные реакции. Исследования многих авторов показали, что активность инвертазы лучше других ферментов отражает уровень плодородия и биологической активности почв.

Уреаза- катализирует реакции гидролитического расщепления мочевины на аммиак и диоксид углерода. В связи с использованием мочевины в агрономической практике необходимо иметь в виду, что активность уреазы выше у более плодородных почв. Она повышается во всех почвах в периоды их наибольшей биологической активности - в июле - августе.

Фосфатаза (щелочная и кислая) - катализирует гидролиз ряда фосфорорганических соединений с образованием ортофосфата. Активность фосфатазы находится в обратной зависимости от обеспеченности растений подвижным фосфором, поэтому она может быть использована как дополнительный показатель при установлении потребности внесения в почвы фосфорных удобрений. Наиболее высокая фосфатазная активность в ризосфере растений.

Протеазы - это группа ферментов, при участии которых белки расщепляются до полипептидов и аминокислот, далее они подвергаются гидролизу до аммиака, диоксида углерода и воды. В связи с этим протеазы имеют важнейшее значение в жизни почвы, так как с ними связаны изменение состава органических компонентов и динамика усвояемых для растений форм азота.

Каталаза - в результате ее активирующего действия происходит расщепление перекиси водорода, токсичной для живых организмов, на воду и свободный кислород. Большое влияние на каталазную активность минеральных почв оказывает растительность. Как правило, почвы, находящиеся под растениями с мощной глубоко проникающей корневой системой, характеризуются высокой каталазной активностью. Особенность активности каталазы заключается в том, что вниз по профилю она мало изменяется, имеет обратную зависимость от влажности почв и прямую - от температуры.

Полифенолоксидаза и пероксидаза - им в почвах принадлежит важная роль в процессах гумусообразования. Полифенолоксидаза катализирует окисление полифенолов в хиноны в присутствии свободного кислорода воздуха. Пероксидаза же катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей. При этом ее роль состоит в активировании перекисей, поскольку они обладают слабым окисляющим действием на фенолы. Далее может происходить конденсация хинонов с аминокислотами и пептидами с образованием первичной молекулы гуминовой кислоты, которая в дальнейшем способна усложняться за счет повторных конденсаций (Кононова, 1963).

Замечено (Чундерова, 1970), что отношение активности полифенолоксидазы (S) к активности пероксидазы (D), выраженное в процентах (), имеет связь с накоплением в почвах гумуса, поэтому эта величина получила название условный коэффициент накопления гумуса (К). У пахотных слабоокультуренных почв Удмуртии за период с мая по сентябрь он составил: у дерново-подзолистой - 24 %, у серой лесной оподзоленной - 26 и у дерново-карбонатной почвы - 29 %.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПОЧВАХ

Биокаталитическая активность почв находится в значительном соответствии со степенью обогащенности их микроорганизмами (табл. 11), зависит от типа почв и изменяется по генетическим горизонтам, что связано с особенностями изменения содержания гумуса, реакции, Red-Ox-потенциала и других показателей по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Как в одних, так и в других почвах все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или А п, имеют низкую активность ферментов, незначительно изменяющуюся в положительную сторону при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой оказывается резко сниженной, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных видах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

11. Сопоставление биогенносга и ферментативной активности почв Среднего Предуралья (Пухидская, Ковриго, 1974)

Активность биокаталитических реакций почв изменяется. Наименьшая она весной и осенью, а наиболее высокая обычно в июле-августе, что соответствует динамике общего хода биологических процессов в почвах. Однако в зависимости от типа почв и их географического положения динамика ферментативных процессов весьма различна.

Контрольные вопросы и задания

1. Какие соединения называют ферментами? Каковы их продуцирование и значение для живых организмов? 2. Назовите источники почвенных ферментов. Какую роль играют отдельные ферменты в почвенных химических процессах? 3. Дайте понятие о ферментативном комплексе почв и его функционировании. 4. Дайте общую характеристику течения ферментативных процессов в целинных и пахотных почвах.

Из многочисленных показателей биологической активности почвы большое значение имеют почвенные ферменты. Их разнообразие и богатство делают возможным осуществление последовательных био­химических превращений, поступающих в почву органических остат­ков.

Название «фермент» происходит от латинского «ферментум» - брожу, закваска. Явление катализа и в настоящее время полнос­тью не разгадано. Сущность действия катализатора заключается в снижении энергии активации, необходимой для химической ре­акции, направляя ее обходным путем через промежуточные ре­акции, которые требуют меньшей энергии, идущие без катализа­тора. Благодаря этому повышается и скорость основной реакции.

Под действием фермента ослабляются внутримолекулярные связи в субстрате вследствие некоторой деформации его молекулы, про­исходящей при образовании промежуточного комплекса фермент-субстрата.

Ферментативную реакцию можно выразить общим уравнением:

E+S -> ES -> Е+Р,

т. е. субстрат (S) обратимо реагирует с ферментом (Е) с образованием фермент-субстратного комплекса (ES). Общее ускорение реакции под действием фермента обычно составляет 10 10 -10 15 .

Таким образом, роль ферментов заключается в том, что они зна­чительно ускоряют биохимические реакции и делают их возможными при обычной нормальной температуре.

Ферменты, в отличие от неорганических катализаторов, облада­ют избирательностью действия. Специфичность действия ферментов выражается в том, что каждый фермент действует лишь на опреде­ленное вещество, или же на определенный тип химической связи в молекуле. По своей биохимической природе все ферменты - высо­комолекулярные белковые вещества. На специфичность ферментных Силков влияет порядок чередования в них аминокислот. Некоторые ферменты помимо белка содержат более простые соединения. На­пример, в составе различных окислительных ферментов содержат­ся органические соединения железа. В состав других входят медь, цинк, марганец, ванадий, хром, витамины и другие органические соединения.

В основу единой классификации ферментов положена специфич­ность к типу реакции, и в настоящее время ферменты подразделяют на 6 классов. В почвах наиболее изучены оксидоредуктазы (катали­зируют процессы биологического окисления) и гидролазы (катали­зируют расщепление с присоединением воды). Из оксидоредуктаз в почве наиболее распространены каталаза, дегидрогеназы, фенолоксидазы и др. Они участвуют в окислительно-восстановительных про­цессах синтеза гумусовых компонентов. Из гидролаз наиболее широ­ко в почвах распространены инвертаза, уреаза, протеаза, фосфата-Mi. Эти ферменты участвуют в реакциях гидролитического распада высокомолекулярных органических соединений и тем самым играют важную роль в обогащении почвы подвижными и доступными рас­тениям и микроорганизмам питательными веществами.

Исследованием ферментативной активности почв занималось боль­шое количество исследователей. В результате исследований доказа­но, что ферментативная активность - это элементарная почвенная характеристика. Ферментативная активность почвы складывается в результате совокупности процессов поступления, иммобилизации и действия ферментов в почве. Источниками почвенных ферментов слу­жит все живое вещество почв: растения, микроорганизмы, животные, грибы, водоросли и т. д. Накапливаясь в почве, ферменты становятся неотъемлемым реактивным компонентом экосистемы. Почва является самой богатой системой по ферментному разнообразию и фермента­тивному пулу. Разнообразие и богатство ферментов в почве позволя­ет осуществляться последовательным биохимическим превращениям различных поступающих органических остатков.

Значительную роль почвенные ферменты играют в процессах гумусообразования. Превращение растительных и животных остат­ков в гумусовые вещества является сложным биохимическим про­цессом с участием различных групп микроорганизмов, а также им­мобилизованных почвой внеклеточных ферментов. Выявлена пря­мая связь между интенсивностью гумификации и ферментативной активностью.

Особо следует отметить значение ферментов в тех случаях, когда в почве складываются экстремальные для жизнедеятельности микро­организмов условия, в частности при химическом загрязнении. В этих случаях метаболизм в почве остается в известной мере неизменным благодаря действию иммобилизированных почвой, и поэтому устой­чивых, ферментов.

Максимальная каталитическая активность отдельных ферментов наблюдается в относительно небольшом интервале рН, который явля­ется для них оптимальным. Поскольку в природе встречаются почвы с широким диапазоном реакции среды (рН 3,5-11,0), то их уровень активности весьма различен.

Исследованиями различных авторов установлено, что активность почвенных ферментов может служить дополнительным диагностиче­ским показателем почвенного плодородия и его изменения в резуль­тате антропогенного воздействия. Применению ферментативной ак­тивности в качестве диагностического показателя способствуют низ­кая ошибка опытов и высокая устойчивость ферментов при хранении образцов.

1.8.4. Биологическая активность почвы

При проведении биомониторинга и биодиагностики почв ведущи­ми являются показатели биологической активности. Под биологиче­ ской активностью следует понимать напряженность (интенсивность) всех биологических процессов в почве. Ее следует отличать от биогенности почвы - заселенности почвы различными организмами. Биологическая активность и биогенность почвы часто не совпадают друг с другом.

Биологическая активность почвы обусловлена суммарным содер­жанием в почве определенного запаса ферментов, как выделенных в процессе жизнедеятельности растений и микроорганизмов, так и ак­кумулированных почвой после разрушения отмерших клеток. Биоло­гическая активность почв характеризует размеры и направление про­цессов превращения веществ и энергии в экосистемах суши, интенсив­ность переработки органических веществ и разрушения минералов.

В качестве показателей биологической активности почв использу­ются: численность и биомасса разных групп почвенной биоты, их про­дуктивность, ферментативная активность почв, активность основных процессов, связанных с круговоротом элементов, некоторые энерге­тические данные, количество и скорость накопления продуктов жиз­недеятельности почвенных организмов.

Из-за того, что важные и всеобщие процессы, осуществляемые в почве всеми или большинством организмов (например, термогенез, количество АТФ), практически невозможно исследовать, определяют интенсивность более частных процессов, таких как выделение СО 2 , накопление аминокислот и др.

Показатели биологической активности определяют, используя раз­личные методы: микробиологические, биохимические, физиологиче­ские и химические.

Биологическая активность почв (и соответственно методов ее определения) подразделяется на актуальную и потенциальную. По­тенциальная биологическая активность измеряется в искусственных условиях, оптимальных для протекания конкретного биологического процесса. Актуальная (действительная, естественная, полевая) био­логическая активность характеризует реальную активность почвы в естественных (полевых) условиях. Измерить ее можно только непосредственно в поле.

Методы определения потенциальной биологической активности почв могут служить хорошими диагностическими показателями потен­циального плодородия почв, степени удобреиности, окультуренности, эродированно, а также загрязненности какими-либо химически­ми веществами. Однако при характеристике интенсивности биологи­ческих процессов, протекающих в естественных условиях, следует пользоваться методами для определения актуальной биологической активности, так как в реальной обстановке лимитирующие факторы (рН среды, температура, влажность и т. д.) могут резко ограничи­вать интенсивность процесса и, несмотря на большие потенциальные возможности, процесс может идти очень медленно.

Важной особенностью показателей биологической активности почв является их значительное пространственное и временное ва­рьирование, что требует при их определении большого числа по­вторных наблюдений и тщательной вариационно-статистической об­работки.

С биологической активностью почвы тесно взаимосвязаны ее фи­зические и химические свойства, такие как гумусовое состояние, структура, щелочно-кислотные условия, окислительно-восстанови­тельный потенциал и другие. Следует отметить, что физические и химические свойства характеризуют относительно консервативные накопившиеся признаки и свойства почв, биология почв располагает показателями динамических свойств, являющихся индикаторами со­временного режима жизни почв.

Для выявления негативных последствий антропогенного воздей­ствия используют мониторинг почвенного покрова. Деградационные явления прежде всего затрагивают биологические объекты, снижая биологическую активность и, в конечном счете, плодородие. По­этому использование методов биологической диагностики, позволя­ет определить негативные последствия антропогенного воздействия на ранних стадиях. Особенно это касается диагностики разных за­грязнений.

Биологические индикаторы обладают рядом преимуществ по сравнению с другими. Во-первых, это высокая чувствительность и отзывчивость на внешние воздействия, во-вторых, они позволяют проследить за негативными процессами на ранних стадиях процес­са, в третьих, только по ним можно судить о воздействиях, не под­вергающих существенному изменению вещественный состав почв

(радиоактивное и биоцидное загрязнение). К существенным недо­статкам можно отнести большую пространственную и временную вариабельность.

В настоящее время разработан большой набор биологических по­казателей, определяющих способность почвы обеспечивать растения факторами жизни, т. е. определяющих потенциальное плодородие почв, и коррелирующих с урожайностью.

По типу катализируемых реакций все известные ферменты разделены на шесть классов:

1. Оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.

2. Гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей в различных соединениях.

3. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного или внутримолекулярного переноса химической группы и остатков с одновременным переносом энергии, заключенной в химических связях.

4. Лигазы (синтетазы), катализирующие реакции соединения двуx молекул, сопряжённые с расщеплением фирофосфатных связей АТФ или другого аналогичного трифосфата.

5. Лиазы, катализирующие реакции негидролитического отщепления или присоединения различных химических групп органических соединений по двойным связям.

6, Изомеразы, катализирующие реакции превращения органических соединений в их изомеры.

В почве широко распространены и довольно подробно изучены оксидоредуктазы и гидролазы, имеющие очень важное значение в почвенной биодинамике.

Каталаза

(Н 2 О 2: Н 2 О 2 –оксидоредуктаза)

Каталаза катализирует реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и молекулярного кислорода:

Н 2 О 2 + Н 2 О 2 О 2 + Н 2 О.

Перекись водорода образуется в процессе дыхания живых орга­низмов и в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ. Токсичность перекиси водорода определяется его высокой реакционной способностью, которую проявляет синглетный кислород, *О 2 . Его высокая реакционная способность приводит к некон­тролируемым реакциям окисления. Роль каталазы заключается в том, что она разрушает ядовитую для организмов перекись водорода.

Каталаза широко распространена в клетках живых организмов, в том числе микроорганизмов и растений. Высокую каталазную активность проявляют также почвы.

Методы определения каталазной активности почвы основаны на измерении скорости распада перекиси водорода при взаимодействии ее с почвой по объему выделяющегося кислорода (газометрические методы) или по количеству неразложенной перекиси, которое определяют перманганатометрическим титрованием или колориметрическим методом с образованием окрашенных комплексов.

Исследованиями Е.В. Даденко и К.Ш. Казеева установлено, что при хранении образцов активность каталазы из всех ферментов снижается в наибольшей степени, поэтому ее определение необходимо проводить в первую неделю после отбора образцов.

Метод А.Ш. Галстяна

Ход анализа. Для определения активности каталазы используют прибор из двух соединенных резиновым шлангом бюреток, которые заполняют водой и уравновешивают ее уровень. Поддерживание определенного уровня воды в бюретках свидетельствует о достижении температурного равновесия в приборе. Навеску (1 г) почвы вносят в одно из отделений сдвоенной колбы. В другое отделение колбы приливают 5 мл 3-процентного раствора перекиси водорода. Колбу плотно закрывают каучуковой пробкой со стеклянной трубкой, которая соединена с измерительной бюреткой с помощью резинового шланга.

Опыт проводят при температуре 20 °С, так как при другой температуре скорость реакции будет отличаться, что исказит результаты. В принципе важна температура не воздуха, а перекиси, именно она должна быть 20 0 С. Если температура воздуха значительно выше 20 0 С (летом), рекомендуется проводить анализ в подвале или в другом прохладном помещении. Рекомендованное в таких случаях применение водяной бани с температурой 20°С вряд ли эффективно.

Начало опыта отмечают по секундомеру или песочным часам в тот момент, когда перекись смешивается с почвой, и содержимое сосуда встряхивают. Взбалтывание смеси производят в течение всего опыта, стараясь не касаться колбы руками, держа ее за пробку. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой отмечают через 1 и 2 мин. Рекомендация определять количество кислорода через каждую минуту в течение 3 мин ввиду прямолинейности реакции разложения перекиси лишь увеличивает затраты времени на анализ.

Данная методика позволяет одному исследователю за день проанализировать активность каталазы более чем 100 образцов. Удобно проводить анализ вдвоем, используя 5-6 сосудов. При этом один человек непосредственно занимается анализом и следит за уровнем бюретки, а второй следит за временем, записывает данные и моет сосуды.

Контролем служит стерилизованная сухим жаром (180°С) почва. Некоторые почвы, соединения и минералы обладают высокой активностью неорганического катализа разложения перекиси даже после стерилизации - до 30-50 % от общей активности.

Активность каталазы выражают в миллилитрах О 2 , выделяющегося за 1 мин из 1 г почвы.

Реактивы: 3-процентный раствор Н 2 О 2 . Концентрацию пергидроля обязательно периодически проверяют, рабочий раствор готовят непосредственно перед анализом. Для установления концентрации пергидроля на аналитических весах в мерной колбе емкостью 100 мл взвешивают 1 г Н 2 О 2 , объем доводят до метки и взбалтывают. Помещают 20 мл полученного раствора в конические колбы на 250 мл (3 повторности), добавляют 50 мл дистиллированной воды и 2 мл 20-процентной Н 2 SO 4 . Затем титруют 0,1 н. раствором КМnО 4 . 1 мл раствора КМnО 4 соответствует 0,0017008 г Н 2 О 2 . После установления концентрации пергидроля готовят 3-процентный раствор разбавлением дистиллированной водой. Титровальный раствор КМnО 4 готовят из фиксанала и выдерживают несколько дней для установления титра.

Дегидрогеназы

(субстрат: НАД (Ф)-оксидоредуктазы).

Дегидрогеназы катализируют окислительно-восстановительные реакции путем дегидрирования органических веществ. Они проходят по следующей схеме:

АН 2 + В А+ ВН 2

В почве субстратом дегидрирования могут быть неспецифические органические соединения (углеводы, аминокислоты, спирты, жиры, фенолы и т.д.) и специфические (гумусовые вещества). Дегидрогеназы в окислительно-восстановительных реакциях функционируют как переносчики водорода и разделяются на две группы: 1) аэробные, передающие мобилизированный водород кислороду воздуха; 2) анаэробные, которые передают водород другим акцепторам, ферментам.

Основным методом обнаружения действия дегидрогеназ является восстановление индикаторов с низким редокс-потенциалом типа метиленовой сини.

Для определения активности дегидрогеназ почвы в качестве водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый - ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазанов (трифенилформазан - ТФФ).

Ход анализа. Навеску (1 г) подготовленной почвы аккуратно через воронку помещают на дно пробирки емкостью 12-20 мл и тщательно перемешивают. Прибавляют 1 мл 0,1 М раствора субстрата дегидрирования (глюкоза) и 1 мл свежеприготовленного 1-процентного раствора ТТХ. Пробирки помещают в анаэростат или вакуумный эксикатор. Определение проводят в анаэробных условиях, для чего воздух эвакуируют при разрежении 10-12 мм рт. ст. в течение 2-3 мин и ставят в термостат на 24 ч при 30 °С. При инкубировании почвы с субстратами толуол в качестве антисептика не прибавляют, так как; он сильно ингибирует действие дегидрогеназ. Контролем служат стерилизованная почва (при 180°С в течение 3 ч) и субстраты без почвы. После инкубации в колбы добавляют 10 мл этилового спирта или ацетона, встряхивают 5 мин. Полученный окрашенный раствор ТФФ фильтруют и колориметрируют. При очень интенсивной окраске раствор разбавляют спиртом (ацетоном) в 2-3 раза. Используют 10-мм кюветы и светофильтр с длиной волны 500-600 им. Количество формазана в мг рассчитывают по стандартной кривой (0,1 мг в 1 мл). Активность дегидрогеназ выражают в мг ТТФ на 10 г почвы за 24 ч. Ошибка определения до 8 %.

Реактивы:

1) 1-процентный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого;

2) 0,1 М раствор глюкозы (18 г глюкозы растворяют в 1000 мл дистиллированной воды);

3) этиловый спирт или ацетон;

4) трифенилформазан для стандартной шкалы. Для составления калибровочной кривой готовят ряд растворов в этиловом спирте, ацетоне или толуоле с концентрацией формазана (от 0,01 до 0,1 мг формазана в 1 мл) и фотоколориметрируют, как описано выше.

При отсутствии формазана его получают восстановлением ТТХ гидросульфитом натрия (сульфитом аммония, порошком цинка в присутствии глюкозы). Исходная концентрация раствора ТТХ 1 мг/мл. К 2 мл исходного раствора ТТХ добавляют на кончике ланцета кристаллический гидросульфит натрия. Выпавший осадок формазана извлекают 10 мл толуола. В таком объеме толуола содержится 2 мг формазана (0,2 мг/мл). Дальнейшим разведением готовят рабочие растворы для шкалы.

Инвертаза

(β-фруктофуранозидаза, сахараза)

Инвертаза является карбогидразой, она действует на β-фруктофуранозидазную связь в сахарозе, раффинозе, генцианозе и др. Наиболее активно этот фермент гидролизует сахарозу с образованием редуцирующих сахаров - глюкозы и фруктозы:

инвертаза

С 12 Н 22 О 11 + Н 2 О С 6 Н 12 О 6 + С 6 Н 12 О 6

сахароза глюкоза фруктоза

Инвертаза широко распространена в природе и встречается почти во всех типах почв. Очень высокая активность инвертазы обнаружена в горно-луговых почвах. Активность инвертазы четко коррелирует с содержанием гумуса и почвенным плодородием. Рекомендуется при изуче­нии влияния удобрений для оценки их эффективности. Методы опреде­ления активности инвертазы почв основаны на количественном учете восстанавливающих сахаров по Бертрану и по изменению оптических свойств раствора сахарозы до и после воздействия фермента. Первый способ может быть применен при изучении фермента с очень широкой амплитудой активности и концентрации субстрата. Поляриметрический и фотоколориметрический способы более требовательны к концентрации сахаров и неприемлемы для почв с высоким содержанием органического вещества, где получаются, окрашенные растворы; поэтому эти методы ограниченно применяются в почвенных исследованиях.

Ферментативная активность почв [от лат. Fermentum - закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы.

Биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность ферментов изменяется по генетическим горизонтам, которые отличаются по содержанию гумуса, типам реакций, окислительно-восстановительным потенциалом и другими показателями по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или Ап, имеют низкую активность ферментов. Активность их незначительно возрастает при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой резко снижается, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных почвах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

Ферментативная активность отражает состояние плодородия почв и внутренние изменения, происходящие при сельскохозяйственном использовании и повышении уровня культуры земледелия. Эти изменения обнаруживаются как при вовлечении целинных и лесных почв в культуру, так и при различных приемах их использования .

По всей Беларуси в пахотных почвах ежегодно теряется до 0,9 т/га гумуса. В результате эрозии ежегодно безвозвратно уносится с полей 0,57 т/га гумуса. Причинами дегумификации почв являются усиление минерализации почвенного органического вещества, отставание процессов новообразования гумуса от минерализации в связи с недостаточным поступлением в почву органических удобрений и снижения ферментативной активности почвы .

Биохимические превращения органического вещества почвы происходят в результате микробиологической деятельности под влиянием ферментов. ферментативный активность почва микроорганизм

Особую роль играют ферменты в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате питательные вещества из трудно усвояемых соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Благодаря каталитической функции они обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций .

Совместно с другими критериями ферментативная активность почв может служить надёжным диагностическим показателем для выяснения степени окультуренности почв. В результате исследований 4, с. 91 установлена зависимость между активностью микробиологических и ферментативных процессов и проведением мероприятий, повышающих плодородие почв. Обработка почв, внесение удобрений существенно изменяют экологическую обстановку развития микроорганизмов.

В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию .

Интерес к применению ферментов вызван еще и тем, что постоянно возрастают требования по увеличению безопасности технологических процессов. Присутствуя во всех биологических системах, являясь одновременно продуктами и инструментами этих систем, ферменты синтезируются и функционируют при физиологических условиях (pH, температура, давление, присутствие неорганических ионов), после чего легко выводятся, подвергаясь разрушению до аминокислот. Как продукты, так и отходы большинства процессов, протекающих с участием ферментов, являются нетоксичными и легко разрушаемыми. Кроме того, во многих случаях, ферменты, используемые в промышленности, получают экологически безопасным путем. От небиологических катализаторов ферменты отличают не только безопасность и повышенная способность к биодеградации, но и специфичность действия, мягкие условия протекания реакций и высокая эффективность. Эффективность и специфичность действия ферментов позволяет получать целевые продукты с высоким выходом, что делает использование ферментов в промышленности экономически выгодным. Применение ферментов способствует сокращению расхода воды и энергии в технологических процессах, уменьшает выбросы в атмосферу CO2, снижает риск загрязнения окружающей среды побочными продуктами технологических циклов .

Применением передовой агротехники можно изменять в благоприятную сторону микробиологические процессы не только пахотного, но и подпахотного слоев почвы.

При непосредственном участии внеклеточных ферментов происходит разложение органических соединений почвы. Так, протеолитические ферменты расщепляют белковые вещества и до аминокислот.

Уреаза разлагает мочевину до СО2 и NH3. Образующийся аммиак и аммонийные соли служат источником азотного питания растений и микроорганизмов.

Инвертаза и амилаза участвуют в расщеплении углеводов. Ферменты группы фосфатов разлагают фосфорорганические соединения почвы и играют важную роль в фосфатном режиме последней.

Для характеристики общей ферментативной активности почвы обычно используют наиболее распространенные ферменты, свойственные подавляющему большинству почвенной микрофлоры - инвертазу, каталазу, протеазу и другие .

В условиях нашей республики проводилось немало исследований 16, с. 115 по изучению изменения уровня плодородия и ферментативной активности почв при антропогенном воздействии, однако полученные данные не дают исчерпывающий ответ на характер изменений из-за сложности сопоставления результатов в виду различия условий проведения опытов и методик исследований.

В связи с этим поиск оптимального решения проблемы улучшения гумусного состояния почвы и ее ферментативной активности в конкретных почвенно-климатических условиях на основе разработки ресурсосберегающих приемов основной обработки почвыё применения почвозащитных севооборотов, способствующих сохранению структуры, предотвращению переуплотнения почвы и улучшению их качественного состояния и восстановлению плодородия почв при минимальных затратах, весьма актуален.